เจ้าหญิงวิกตอเรีย ยูจีนีได้ทรงเข้าพิธีอภิเษกสมรสกับพระเจ้าอัลฟอนโซในวันที่ 31 พฤษภาคม พ.ศ. 2449 ณ พระอารามหลวงซานเคโรนิโม ในกรุงมาดริด โดยมีพระชนนีม่ายของเจ้าหญิง พร้อมด้วยเจ้าชายและเจ้าหญิงแห่งเวลส์ (ซึ่งต่อมาคือ พระเจ้าจอร์จที่ 5 และ สมเด็จพระราชินีแมรี่) ซึ่งเป็นพระญาติใกล้ชิดของเจ้าหญิงเสด็จมาร่วมในงานพระราชพิธี

หลังจากพระราชพิธีราชาภิเษกสมรส ขบวนเสด็จกำลังมุ่งหน้ากลับสู่พระราชวังหลวงเมื่อมีเหตุการลอบปลงพระชนม์องค์พระประมุขและพระมเหสีองค์ใหม่ (ซึ่งตอนนี้คือ "สมเด็จพระราชินีวิกตอเรีย ยูจีเนีย" หรือ "พระราชินีเอนา" ในแบบเป็นไม่เป็นทางการ) มาเตอู มอร์ราล ซึ่งเป็นพวกลัทธิอนาธิปไตยได้ขว้างระเบิดลูกหนึ่งจากระเบียงตึกไปยังรถม้าพระที่นั่ง พระราชินีทรงปลอดภัยเนื่องจากขณะที่เกิดการระเบิดขึ้นทรงหันพระพักตร์ไปเพื่อจะทอดพระเนตรโบสถ์เซนต์แมรี่ ซึ่งพระราชสวามีกำลังทรงชี้ให้ทอดพระเนตร พระองค์ทรงรอดพ้นจากการบาดเจ็บ แม้ว่าฉลองพระองค์จะเต็มไปด้วยจุดเลือดของราชองครักษ์ ซึ่งได้ขี่ม้าขนาบข้างรถม้าพระที่นั่งก็ตาม

หลังจากการเริ่มต้นที่ไม่เป็นมงคลของการดำรงพระอิสริยยศเป็นสมเด็จพระราชินีแห่งสเปน พระองค์ทรงโดดเดี่ยวจากพสกนิกรชาวสเปนและไม่เป็นที่นิยมชมชอบในประเทศใหม่ของพระองค์ แต่ชีวิตการสมรสของพระองค์ก็พัฒนาขึ้นเมื่อทรงมีประสูติกาลพระโอรสและรัชทายาทแห่งราชบัลลังก์คือ เจ้าชายอัลฟอนโซ อย่างไรก็ตาม ขณะที่เจ้าชายน้อยกำลังทรงรับการขลิบอวัยวะเพศนั้น เหล่าแพทย์ได้สังเกตว่าพระโลหิตไม่หยุดไหล อันเป็นสัญญาณแรกที่เจ้าชายรัชทายาททรงเป็นโรคฮีโมฟีเลีย พระราชินีทรงเป็นต้นตอของสาเหตุอย่างเห็นได้ชัด ซึ่งทรงถ่ายทอดไปยังพระโอรสองค์ใหญ่และองค์เล็ก ทั้งนี้แตกต่างจากการตอบสนองของจักรพรรดินิโคลัสที่ 2 แห่งรัสเซีย ซึ่งพระราชโอรสและรัชทายาทในราชบัลลังก์อันประสูติแต่พระราชนัดดาอีกพระองค์ในสมเด็จพระราชินีนาถวิกตอเรียทรงได้รับความทุกข์ทรมานที่คล้ายคลึงกัน พระเจ้าอัลฟอนโซมิเคยพระราชทานอภัยโทษแก่พระราชินีเอนาหรือทรงตระหนักถึงสิ่งที่ได้เกิดขึ้นแม้แต่น้อยเลย แม้กระนั้นพระเจ้าอัลฟอนโซที่ 13 และสมเด็จพระราชินีวิกตอเรีย ยูจีเนียมีพระราชโอรสและธิดาเจ็ดพระองค์ พระราชโอรสห้าพระองค์และพระราชธิดาสองพระองค์ พระธิดาทั้งสองพระองค์มิได้ทรงเป็นพาหะของโรคเฮโมฟีเลีย

หลังจากการประสูติของพระราชโอรสและธิดาแล้ว ความสัมพันธ์ระหว่างของพระราชินีเอนากับกษัติรย์อัลฟอนโซก็คลอนแคลนมากขึ้น กษัตริย์อัลฟอนโซทรงถูกระแวงว่ามีความสัมพันธ์นอกสมรสมากมาย รวมถึงการทรงใช้เวลาว่างอย่างเสเพลกับเจ้าหญิงเบียทริซแห่งออร์เลอ็อง-บอร์บอน พระญาติชาวอังกฤษของพระราชินีเอนา

พระราชินีเอนาทรงอุทิศพระองค์ในการทรงงานในโรงพยาบาลและการช่วยเหลือคนยากจน รวมถึงการศึกษาด้วย พระองค์ยังทรงมีส่วนเกี่ยวข้องในการจัดตั้งองค์กรกาชาดแห่งสเปนขึ้นมาใหม่อีกด้วย